本科生畢業論文（設計）開題報告

題目： 菌寄生真菌纖細齒梗孢蛋白酶基因的克隆與表達

姓名： ** 學號： ****

年級： *** 專業： 植物保護

指導教師：姓名 *** 職稱 教授

學科 植物病理

山東農業大學教務處

二○○ 年 五 月 十八 日

一、選題依據(擬開展研究項目的研究目的、意義)

菌寄生(mycoparasitism)是發生在菌寄生真菌與寄主真菌之間的一種寄生方式，是自然界普遍存在的一種真菌與真菌之間的相互作用。一直以來，生物間相互作用及信號傳導的分子機制，是當今生命科學研究的熱門。利用菌寄生真菌與寄主真菌作爲研究的模式系統來揭示生物相互之間的相互作用機制有重要理論和實踐意義。李多川(li,1996)先生髮現纖細齒梗孢(olpitrichum tenellum)和串珠鐮刀菌(fusarium moniliforme)的菌寄生關係以來，我們實驗室試圖通過研究纖細齒梗孢和串珠鐮刀菌，來建立菌寄生真菌與寄主真菌相互作用機制研究的模式系統，從而揭示菌寄生真菌與寄主真菌之間相互作用的分子機制。纖細齒梗孢(olpitrichum tenellum)是串珠鐮刀菌的一種重寄生真菌，該菌是一種接觸性活體重寄生菌，離體試驗發現其分生孢子只有在串珠鐮刀菌細胞壁提取物刺激下才能萌發。這說明兩者之間的重寄生關係是建立在二者識別與互作的分子機制上的(li,XX)。在纖細齒梗孢和串珠鐮刀菌相互作用過程中，幾丁質酶、蛋白酶等細胞壁裂解酶可能起到重要作用。其中，蛋白酶在木黴屬菌寄生真菌中的功能已經得到初步證明，而纖細齒梗孢的蛋白酶的研究還未見報道。因此，克隆纖細齒梗孢蛋白酶編碼基因對於從分子水平上研究重寄生真菌和寄主識別和互作機制有着重要的意義。

二、文獻綜述內容(在充分收集研究主題相關資料的基礎上，分析國內外研究現狀，提出問題，找到研究主題的切入點，附主要參考文獻)

纖細齒梗孢(olpitrichum tenellum)是李多川教授分離得到的一種活體營養接觸型菌寄生真菌[1~3]，其寄主包括fusarium moniliformealternaria alternata等。近年來，我們實驗室一直在努力以其爲基礎研究菌寄生真菌與寄主真菌之間的相互作用的分子機制。經過多年的研究，人們漸漸認識到真菌細胞壁蛋白在細胞與外界的相互作用過程中扮演着重要的角色。細胞壁蛋白研究已經成爲生物間相互識別機制研究的熱點。鑑於以上原因，我們實驗室成功分離純化了纖細齒梗孢的寄主之一alternaria alternata菌絲細胞壁上的一種特異性糖蛋白——凝集素，並初步證明其在rnaria和llum孢子吸附過程中起到識別因子的作用[4]。近年來，菌寄生真菌細胞壁裂解蛋白酶在菌寄生過程中的作用被人們逐漸重視起來。克隆和表達菌寄生真菌的蛋白酶編碼基因變得很有意義。本研究試圖以菌寄生真菌纖細齒梗孢(olpitrichumtenellum)作爲研究材料克隆了其蛋白酶基因。根據氨基酸的保守序列設計兼併引物，然後採用rt-pcr和race是一個較爲快速、簡單和高效的方法。本實驗根據同源保守序列設計兼併引物，通過rt-pcr及race-pcr的方法，克隆了llum蛋白酶的編碼基因的全長cdna序列，並對該基因進行了序列分析，爲後續試驗打下了基礎。

由於olpitrichum tenellum在離開寄主的人工培養基中很難生長，純化其蛋白酶變得非常困難。因此，我們需要使用外源蛋白表達系統得到蛋白，進一步研究其性質，從而搞清楚其在重寄生過程中的作用。在過去的幾十年間，隨着dna重組技術的不斷髮展，通過構建遺傳工程菌株，人們可以較容易地使各種各樣的天然酶的基因在微生物系統中高效表達，從而在很大程度上擺脫對天然酶源的依賴。

基因工程的表達系統有原核表達系統和真核表達系統兩大類。在原核表達系統中，大腸桿菌表達系統是目前瞭解最深入，實際應用最爲廣泛的表達系統。與其他表達系統相比，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚、目標基因表達水平高、培養週期短、抗污染能力強等特點。在基因表達技術中佔有重要的地位，是分子生物學研究和生物技術產業化發展進程中的重要工具[5]。

pichia pastoris基因表達系統經過十幾年發展，已基本成爲較完善的外源基因表達系統，具有易於高密度發酵，表達基因在宿主基因組中穩定整合，能使產物有效分泌並適當糖基化，培養方便經濟等特點。利用強效可調控啓動子aox1，已高效表達了hbsag、tnf、egf、破傷風毒素c片段、基因工程抗體等多種外源基因[6]，證實該系統是高效、實用、簡便，能提高表達量並保持產物生物學活性的外源基因表達系統。oris表達系統在生物工程領域將發揮越來越重要的作用，促進更多外源基因在該系統的高效表達，提供更爲廣泛的基因工程產品[7]。

我們已經分離到llum蛋白酶的編碼基因，本研究中將該基因的去掉信號肽序列的正確閱讀框融合於原核表達載體pet-22b(+)和畢赤酵母表達載體ppic9k上，分別轉化 bl21及pichia pastoris gs115，以期在這些菌株中有效表達該基因的編碼產物，從而爲以後功能研究打下基礎。

1 李多川.1998.菌寄生真菌分子生物學研究進展.吉林農業大學學

報,20：37~65.

2 21.李多川.1998.菌寄生真菌分子生物學研究進展.微生物學通報，25：

345~347.

3 .李多川，沈崇堯.1997.菌寄生菌物與寄主菌物相互作用的研究進展.

西北農業學報，6：94~98.

4 張成省，李多川，孔凡玉rnaria alternata菌絲細胞壁凝集素

的純化與特性研究.植物病理學報，35(2)：141~147.

5 .11.何誠，朱運鬆.1998.甲醇營養型酵母表達系統的研究進展.生物工程

進展,18:7~11.

6 彭毅，楊希才，康良儀.影響甲醇酵母外源蛋白表達的因素.生

物技術通報，4:33~36.

7 韓雪清，劉湘濤，尹雙.畢赤酵母表達系統.微生物學雜誌，

3:35~40.

三、研究方案(主要研究內容、目標，研究方法、進度)

一、研究內容：

本課題選擇纖細齒梗孢(olpitrichum tenellum)做爲研究對象，通過rt-pcr及race技術分離克隆了其絲氨酸蛋白酶基因，並進行原核及真核表達，並對其的性質進行了研究，爲進一步的研究工作打下基礎。

二、研究的目標：

克隆了纖細齒梗孢(olpitrichum tenellum)的絲氨酸蛋白酶基因，進行原核及真核表達，並對其的性質進行了研究。

三、研究方法

將纖細齒梗孢(olpitrichum tenellum)接種到lb培養基上，培養14個小時後，收集菌絲，然後採用總trizol法提取rna。再從genbank數據庫中搜索到大量的蛋白酶氨基酸序列，並根據同源性進行分類，分別設計兼併引物。再通過rt-pcr、3’-race、5’-race獲得全長cdna、dna克隆，並將其連接到載體上，然後採用電擊法將將重組質粒轉入到全長cdna、dna克隆中，通過透析純化蛋白酶，最後研究其特性。

四、研究進度：

XX年5月23日~XX年5月29日 整理收集資料，並跟着研究生學習基本實驗技術。

XX年5月30日~XX年6月18日 提取rna，設計引物、全長cdna、dna克隆 。

XX年6月19日~XX年7月15日 轉化大腸桿菌、畢赤酵母表達，獲得純純產物，並研究其特性。

XX年3月~XX年6月 對實驗結果不理想的實驗重做，整理實驗數據，完成畢業論文，並準備畢業答辯。

五、技術路線：

收集菌絲

總rna提取

同源序列 設計引物

特性研究

rt-pcr、

3’-race、5’-race

純化表達產物

全長cdna、dna克隆 轉化大腸桿菌、畢赤酵母

四、進程計劃(各研究環節的時間安排、實施進度、完成程度)

XX年5月23日~XX年5月29日 整理收集資料，並跟着研究生學習基本實驗技術。完成實驗的1%。

XX年5月30日~XX年6月18日 提取rna，設計引物、全長cdna、dna克隆。完成實驗的50%。

XX年6月19日~XX年7月15日 轉化大腸桿菌、畢赤酵母表達，獲得純純產物，並研究其特性。完成實驗的95%。

XX年3月~XX年6月 對實驗結果不理想的實驗重做，整理實驗數據，完成畢業論文，並準備畢業答辯。完成100%。

五、導師對文獻綜述的評語

簽字：

200 年 月 日

六、 專業意見

專業主任簽字：

200 年 月 日

七、學院意見

學院(章)： 負責人簽字：

200 年 月 日